一提到对肿瘤的研究，必离不开对细胞功能的研究，其中肿瘤细胞的迁移、侵袭功能研究是必不可少的，肿瘤细胞的迁移侵袭能力的研究，也为后续信号通路、功能机制研究打下基础。所以，做好TRANSWELL实验是多么的必要，下面我们将详细介绍TRANSWELL这个实验。所谓TRANSWELL，顾名思义，TRANS-词根具有转运，转移，移动的意思，WELL-为小室的意思，两个词合起来就是穿过小室的实验，很多人到这里并没有想象到这是个什么装置，下面以corning公司（也可以是其他家的，大同小异）的24孔TRANSWELL小室为例给大家讲解。
图1. Transwell孔板
首先要说一下，示例的这个小室为24孔板，打开后发现真正可以做的为12个孔（图1），单个一个小室的话，如示例（图2）；肿瘤迁移与侵袭实验常用8.0或12.0μM的膜就足够，在肿瘤迁移实验时，在上室中我们加上无血清的培养液与细胞，在下室加入有血清的培养液，相当于肿瘤细胞在上室没有食物，本能会向下室有食物的培养基跑去，而我们所要检测的就是细胞跑下去的能力，换句话说，细胞跑下去的越多，肿瘤迁移的能力也就越强，如示例图3。
图2. Transwell单个小室
图3. 肿瘤Transwell迁移示意图
在肿瘤侵袭实验时，其原理与肿瘤迁移一致，只不过在聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶（matrigel），用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力，如示例图4。
图4. 肿瘤Transwell侵袭示意图
下面将介绍TRANSWELL的详细实验步骤及每一步笔者的一些经验供大家分享：1、复苏细胞，将细胞复苏于含有10%的血清中培养传代，传至2-3代时进行加药处理或者饥饿处理18-24小时，这一步我们要保证细胞的状态是否正常，无论加药与否，都需要大家前期在细胞方面注意；2、在4度冰箱中溶解matrigel胶，这一步切记，不要把胶在室温存放太长时间，否则胶就凝固啦，室温下的胶在没有稀释的情况下很容易凝固，也就不能用了；3、提前将实验所用到的细胞小室，枪头等放入4度中预冷，同理，防止胶过早凝固，我们需要将实验所需的东西全部预冷；4、用无血清的培养基稀释matrigel胶，加入到上室，具体的浓度小伙伴们可以看一下所购买的matrigel胶的说明书，有推荐的比例与稀释浓度，且这一步必须在冰上进行，也是防止胶在没有稀释的时候凝固，而且matrigel胶真的很贵，所以刚拿到胶的小伙伴一定记住要及时分装哈。不同的细胞适用于不同的胶的浓度，浓度过高过低都会影响实验的结果，肿瘤细胞建议稀释比例为1:8-1:9；5、将铺好的胶放于37℃的培养箱中，使其充分凝固，笔者在这里更喜欢放置过夜哈，可以让稀释的胶充分凝固；6、利用无血清的细胞培养液稀释细胞至100μL，加入到小室中，切记上室是无血清的，这样细胞才会向着有血清的下室穿过去；7、下室加入含有10%血清的培养基600μL，切记下室是有血清的，才会吸引上室无血清的细胞穿过来；8、放入37度培养箱中进行培养24-72小时，诱导细胞穿下基质胶，培养的时间小伙伴们还得根据自己的实验进行摸索哈，笔者做的胃癌细胞功能测定一般就24小时；9、取出后，将上室和下室的多余液体吸出，并用PBS清洗上室（200μL），下室（600μL），清洗两遍，注意！多清洗清洗效果更好哈，笔者深有体会；10、用甲醇或4%多聚甲醛固定15分钟，细胞固定不好，拍照焦头烂额，固定不好的话，小心不好染色呀，笔者亲身经历；11、用吉姆萨染料或0.5%结晶紫染料进行染色20分钟，小伙伴们根据说明书来哈！；12、用PBS清洗小室3遍，清洗干净后进行拍照（结晶紫染色的话需要33%的醋酸进行脱色），这里的小伙伴们注意啦，如果背景颜色特别深且杂乱，很容易在投稿时被返修及退稿呀，笔者有过相同的经历，因为背景特备深而被返修，如图5；
图5. Transwell实验背景颜色深示意图
13、利用软件Image J进行细胞计数，并做最后的统计。14、肿瘤细胞迁移实验与侵袭实验不一样在于，迁移实验不用提前铺matrigel胶。总之，研究肿瘤的功能试验离不开Transwell，虽然是小小的实验，但是每一步都有我们需要注意的地方，这里需要大家注意细节，所谓细节决定成败，最后笔者祝大家实验顺利，文章大发!
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